Диагностика плацентарной дисфункции на поздних сроках беременности у кобыл

2015-01-01

Потапова А.Ю., Дмитриева Т.О. (СПбГАВМ)

Ключевые слова: кобылы, беременность, плацентарная недостаточность, релаксин, иммунохимия.

Key words: mare, pregnancy, placental insufficiency, relaxin, immunochemistry assay

В данной статье освещен метод иммунохимии для детекции релаксина в крови лошади, и уточняется его диагностическая значимость метода. В основе метода лежит иммунохроматографический анализ дефибрилированной крови со стандартным антигеном RLN2 (релаксин 2 лошади). Проведено рандоминизированное исследование диагностической эффективности полученных тест-систем. 10 животных были беременны (9-11 месяц) и имели благополучную репродуктивную историю. Беременность установлена методом УЗИ. Другие 10 животных наоборот имели в анамнезе 2 и боле абортов, а при проведении гормонального исследования крови, был установлен дисбаланс стероидных гормонов. От каждого животного было исследовано 2 пробы крови (40 тестов). Установлено, что пробы крови беременных лошадей окрашивали тест-полоски в малиновый цвет. 6 тестов показали сомнительный результат (30%). Пробы крови лошадей с патологией плодоношения не окрашивали тест-полоску в малиновый цвет. 5 результатов было сомнительных (25%). Сомнительные тесты получены либо из-за нарушений проведения условий тестирования, либо из-за технических неточностей при ручном изготовлении тест-систем. Полученные результаты говорят о целесообразности дальнейшего изучения иммунохимической детекции релаксина в крови и усовершенствовании тест-полосок для этих целей.

Введение

В настоящее время большой интерес вызывает разработка и внедрение в практику экспресс-индикаторов физиологического состояния организма животного. Современный уровень клинической диагностики позволяет создавать тест-системы с высокой чувствительностью и точностью прогнозов. Большую популярность приобрела методика иммунохроматографии благодаря своей простоте и точности [6, 10].

Иммунохроматографический анализ (ИХА) — иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующим ему антителом в мембране. Проводится с помощью специальных тест полосок, панелей или иных тест-систем [7].Тест- система представляет собой мультимембранный композит, на определенные участки которого предварительно нанесены все необходимые для анализа реагенты [13, 16]. Контакт с жидкой пробой инициирует движение ее компонентов вдоль мембран тест-системы под действием капиллярных сил (рисунок 1).

Строение ИХА тест-системы

Рис. 1. Строение ИХА тест-системы

Принцип действия состоит в том, что при нанесении биологической жидкости (кровь, сыворотка, моча, гемогинезат тканей) на тест, она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом [1, 11].По мере продвижения растворов мембрана последовательно окрашивается в области фронта жидкости. Появление на мембране двух окрашенных полос свидетельствует о положительном результате исследования: выявлении антигена в концентрации не ниже контролируемой [12].

При диагностике плацентарной недостаточности целесообразно использовать в качестве антигена релаксин – белковый гормон плаценты. [2, 3]. Этопептидный гормон с молекулярной массой 6500 Да, принадлежащий к семейству инсулино-подобных гормонов [15]. Релаксин синтезируется в большом количестве клетками плацентарного комплекса, за счет чего является наиболее информативным маркером его функционального состояния. В норме релаксин на 44 неделе в крови кобыл определяется в концентрации не ниже 58 нг/мл[13, 14]. Исследования показали, что снижение релаксина ниже данной границы свидетельствует о развивающейся плацентарной недостаточности с последующей угрозой аборта. Физиологическая роль релаксина в поддержании благополучия беременности у кобыл объясняется следующим: 1) расширение сосудов матки и плацентарного комплекса; 2) хронотропное действие на сердечную мышцу; 3) угнетение агрегации тромбоцитов и их релиз в мегакариоцитах; 4) влияние на секрецию гормонов гипофиза; и 5) регуляция баланса жидкости [21, 33].

Релаксин был открыт в 1977 году Швабе. Позже была расшифрована его пространственная структура с учетом видовых особенностей десятка животных, в том числе и лошади. Стевард Д.Р. в 1991 году опубликовал статью о методе очистки нативного релаксина лошади. Данные открытия позволили создавать синтетический релаксин, пригодный для производства тест-систем в качестве аналитически чистого стандартного образца релаксина [9].

Для собак, кошек, свиней, коров и лошадей были созданы иммуноферментные и иммунорадиоактивные методы детекции релаксина в биологических жидкостях. Данные методики трудоемки, воспроизводятся только в лабораторных условиях в течение суток и пригодны только в научных целях. Особую популярность на рынке диагностикумов приобрели ИХА тесты на релаксин для собак и кошек. Однако пока не получено ни одного патента на метод иммунохроматографического анализа релаксина у лошадей [4, 5, 8].

Материалы и методы

Работа проходила в несколько этапов. Первый: получение гипериммунной сыворотки к релаксину лошади по короткой схеме иммунизации кроликов. Второй: получение поликлональных антител к релаксину лошади из гипериммунной сыворотки кроликов методом аффинной очистки. Третий: получение конъюгатаполиклональных антител к релаксину лошади с коллоидным золотом. Четвертый: получение антивидовой сыворотки на мышах, иммунизируя их по короткой схеме поликлональными антителами кролика к релаксину лошади. Пятый: получение поликлональных антител мыши к поликлональными антителами кролика к релаксину лошади. Шестой: нанесение иммобилизованных поликлональных антител к релаксину лошади и поликлональных антител мыши в зону тест-полоски и контроль- полоски соответственно. Нанесение конъюгата на специальную мембрану.

В эксперименте использовались 5 кроликов породы шиншилла и 5 белых мышей для получения поликлональных сывороток. Кроликам вводили антиген RLN2 (релаксин 2 лошади, HolzelDiagnostikaGmbH, Германия) дважды с двух- недельным интервалом подкожно в подушечки задних лап. Первое введение – 100 мкг антигена на животное. Раствор антигена смешивали с 200 мкг адъюванта Фрейда. Второе введение – 100 мкг с 200 мкг неполным адъювантом Фрейда. На третий день после повторной иммунизации отбиралась кровь из ушной вены (10 мл) в центрифужную стерильную пробирку JetBiofit (Россия). Мышам вводился полученный на кроликах анти-антиген по той же схема (рисунок 2).

Строение ИХА тест-системы

Рис. 2. Получение поликлональных сывороток

При получение поликлональных антител клеточные элементы из сывороток удалялись цен- трифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин. Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревали в течение 30 мин при 56° С. Использовалась афинно очищенная IgG- фракция иммунной сыворотки. Её получение, а также конъюгация антигена с коллоидным золотом проводили по стандартным протоколам.

Изготовление тест-систем включало следующие стадии: 1 – нанесение растворов на рабочую мембрану для формирования аналитической и контрольной зон; 2 – нанесение раствора конъюгата маркер-антитело на стекловолоконную мембрану; 3 – высушивание мембран с нанесенными реагентами; 4 – последовательное приклеивание мембран на пластиковую основу (рисунок 3).

Строение ИХА тест-системы

Рис. 3. Последовательность сбора тест-системы.

На первой стадии на лист рабочей мембраны с помощью микропипетки наносили раствор для формирования контрольной зоны. На стекловолоконную мембрану наносили конъюгат КЗ-антитела при помощи ручного распылителя. Мембраны высушивали и проводили сборку мультимембранного композита, включающего рабочую мембрану, мембраны для конъюгата и образца и впитывающую мембрану.

На последней стадии изготовления наносили аналитическую зону – массив из микроточек. Характеристика микропипетки: объем 1 мг, внутренний диаметр пина – 200 мкм. Объем наноси- мой капли – 20 нл, диаметр формирующейся точки в аналитической зоне мембраны – 250 мкм.

Аналитическая зона находилась на расстоянии 3-х см от подушки с конъюгатом. Тестовая зона – на расстоянии 0,4 см от аналитической зоны.

После нанесения иммунореагентов, мембраны высушивали в течение 20 часов. В помещении, в котором производили нанесение реагентов, поддерживалась температура 20-22°С и влажность не выше 30%.

Результаты исследований и их обсуждение

Было проведено рандоминизированное исследование диагностической эффективности на 20 кобылах. 10 животных были беременны (9-11 месяц) и имели благополучную репродуктивную историю. Беременность установлена методом УЗИ. Другие 10 животных наоборот имели в анамнезе 2 и боле абортов, а при проведении Рис. 1. Строение ИХА тест-системы Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии, гормонального исследования крови, был установлен дисбаланс стероидных гормонов.

В пробирку с 0,1 мл гепарина добавляли 1 мл венозной крови. Пробирку закрывали и медленно переворачивали в течение 30 секунд для перемешивания. Добавляли 1 каплю пробы крови из пробирки на мембрану для пробы. Оставляли тест-систему в горизонтальном положении. Читали результат через 5 минут. Две полоски свидетельствовали о достаточном количестве релаксина (беременность проходит нормаль). Одна контрольная полоска свидетельствует о снижении концентрации релаксина в крови (диагноз плацентарной недостаточности). Одна тестовая полоска, отсутствие полосок или сплошной малиновый фон говорили о нарушении проведения условий теста или о неисправности тест-системы.

От каждого животного было исследовано 2 пробы крови (40 тестов). Было установлено, что пробы крови беременных лошадей окрашивали тест-полоски в малиновый цвет. 6 тестов показали сомнительный результат (30%). Пробы крови лошадей с патологией беременности не окрашивали тест-полоску в малиновый цвет. 5 результатов было сомнительных (25%).Сомнительные тесты были получены либо из-за нарушений проведения условий теста, либо из-за технических неточностей при ручном изготовлении тест- систем. Тем не менее, полученные результаты говорят о целесообразности дальнейшего изуче- ния иммунохимической детекции релаксина в крови и усовершенствовании тест-полосок для этих целей.

Исследования проведены при финансовой поддержке ФГБУ "Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере" (Фонд содействия инновациям). Договор о предоставлении гранта № 3514ГУ1/2014 от 18.09.2014 г.

Diagnosis of placental dysfunction in late pregnancy in mares. Potapova А., Dmitrieva Т.

SUMMARY

The article is carried out the immunochemistry method for the detection of equine relaxin in blood. Diagnostic value of the method is alsoclarified. The method is based on immunoassay of defibrinated blood with a standard antigen RLN2 (relaxin 2 equine). The randomness study of the effectiveness of the method was performed. 10 mares were pregnant (9-11 month) and had a positive reproductive history. Pregnancy was established by ultrasonic examination. The other 10 animals had a negative reproductive history with more than 2 abortions, while blood for hormonal research was set steroid hormone imbalance. Two blood samples were tested from each animal (40 tests). Blood samples of pregnant mares stained the test with crimson color. 6 tests showed unreliable results (30%). Blood samples of other mares did not stainthe test with color. 5 results were unreliable (25%). Questionableresults probably were obtained because of nonobservance of the test conditions or due to technical inaccuracies of hand-made test systems. The results show the feasibility of further study of immunochemical detection of relaxin in blood and improving method for these purposes.

Литература

  1. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферменного анализа. М.: Высшая школа, 1991. — 287 с.
  2. Милованов А.П. Патология системы мать-плацента-плод, Руководство для врачей. М.:—Медицина, 1999. — 448 с: ил. Рис. 2. Получение поликлональных сывороток. Рис. 3. Последовательность сбора тест-системы. Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии, № 1, 2015 г. 103
  3. Филиппов О.С. Плацентарная недостаточность / О.С. Филиппов. – М. :МЕДпресс-информ, 2009. – 160 с. : ил.
  4. Федорова М.В., Калашникова Е.П. Плацента и её роль при беременности. – М.: Медицина, 1986, 256 с., ил.
  5. Anna Brecht, Cornelia Bartsch, Gert Baumann, Karl Stangl, Thomas Dschietzig. Relaxin inhibits early steps in vascular inflammation. Regulatory Peptides - REGUL PEPTIDES, vol. 166, no. 1, pp. 76-82, 2011.
  6. Christian Schwabe and Erixa E Bullesbach. Relaxin: structures, functions, promises, and nonevolution. The FASEB JournalVol. 8 November 1994 pp 1152 – 1160
  7. Fitzpatrick J., Fanning L., Hearty S., Leonard P., Manning B.M., Quinn J.G., O'Kennedy R. Applications and recent developments in the use of antibodies for analysis // Analytical Letters. 2000. — V. 33, No 13. — P. 2563-2609.
  8. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. NY: Academic Press, 2008. — 1323 p.
  9. Hong, C. B. et al. 1993. J. Veter. Diag. Invest. 5:550-566
  10. Hong C.B., Donahue J.M., Giles R.C. et al. Etiology and Patology of Equine Placentitis. JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation. 5: 56 – 63 (1993)
  11. Koivunen M.E., Krogsrud R.L. Principles of immunochemical techniques used in clinical laboratories // LabMedicine. 2006. — V. 37, No 8. — P. 490-497.
  12. Qian S., Bau H.H. Analysis of lateral flow biodetectors: competitive format // Analytical Biochemistry. 2004. — V. 326, No 2. — P. 211-224.
  13. Ryan, P. L. et al. 1997. Proc. 15th Equine Nutrition and Physiology Symposium, Fort Worth, Tex., May 28-31
  14. Sherwood, O. D. 1994. In: The Physiology of Reproduction, Second Edition. E. Knobil and J. D. Neill (eds.), Raven Press: New York, pp. 861-1009
  15. Sutton J.B., Swift S.T. Library of veterinary practice. Allen`s Fertility and Obstetrics in the horse. Secondedition, Blackwell, England, 1996
  16. Wong R.C., Tse H.Y. Lateral Flow Immunoassay. — NY: Humana Press, 2009. —236 p. УДК 615.357:615.28:612.6:636.2
У моей собаки снова прекрасный стул

У моей собаки снова прекрасный стул

2020-09-28

Сегодня тема нашей беседы - опухоли влагалища у сук

Подробнее

Пиелонефрит в патогенезе пиометры

Пиелонефрит в патогенезе пиометры

2020-05-07

Статья освещает патогенез заболеваний мочеполовой системы. Цель исследования определить риск возникновения послеоперационных осложнений при разных формах премедикации.

Подробнее

Диагностика послеродовой гипокальциемии

Диагностика послеродовой гипокальциемии

2020-05-04

Одной из актуальных проблем при разведении крупного рогатого скота является высокий процент возникновение послеродовых патологий у высокопродуктивных животных, среди которых одним из актуальных вопросов является гипокальциемия крупного рогатого скота.

Подробнее

Селекционный контроль качества молока овцематок

Селекционный контроль качества молока овцематок

2019-03-01

Изучали селекционные показатели качества молока овцематок катумской породы в период раздоя как основного стимулятора роста и развития ягнят

Подробнее

Алопеция Х у померанских шпицев

Алопеция Х у померанских шпицев

2018-05-08

В статье на основе данных статистического анализа клинических случаев проявления ало- пеции Х у померанских шпицев дано обоснование актуальности данной болезни и необходимости разра- ботки генетических тестов

Подробнее

Профилактика мастита у овец катумской породы

Профилактика мастита у овец катумской породы

2018-04-01

В работе дана оценка препарата «Велактис» с активным действующим веществом каберголин, профилактирующим мастит у овец после отъема ягнят

Подробнее

Использование УЗИ в мясном овцеводстве

Использование УЗИ в мясном овцеводстве

2018-02-01

Проведена оптимизация работы с ультразвуковым датчиком в условиях овцеводческого хозяйства

Подробнее

Создание мясного овцеводства в Северо-Западном Федеральном округе РФ

Создание мясного овцеводства в Северо-Западном Федеральном округе РФ

2018-01-01

В работе обобщены практические данные по развитию мясного овцеводства, полученные за последние 10 лет в сельскохозяйственном предприятии ООО СХП «Катумы» Всеволожского района Ленинградской области.

Подробнее

Профилактика акушерской патологии у высокопродуктивных коров при применении кормовой смеси «Бизон»

Профилактика акушерской патологии у высокопродуктивных коров при применении кормовой смеси «Бизон»

2015-04-01

В данной статье освещен метод коррекции воспроизводительной функции у высокопродуктивных коров за счет введения в рацион в транзитный период кормовой смеси «Бизон» на основе пропионата хрома.

Подробнее

Эффективность синтетического бета-каротина в стабилизации полового цикла у сук при дисфункции яичников

Эффективность синтетического бета-каротина в стабилизации полового цикла у сук при дисфункции яичников

2015-03-01

В статье рассмотрены причины дисфункции яичников и нарушения половой цикличности у сук.

Подробнее

Коррекция полового цикла у кошек

Коррекция полового цикла у кошек

2014-03-01

В данной статье рассматриваются особенности проявления течки племенных кошек, выясняется этиология алиментарного бесплодия и предложена методика его лечения и профилактики препаратом «Маримикс 5:0»

Подробнее

Заказать обратный звонок
Наверх

Мы используем cookies! Продолжая пользоваться сайтом, вы соглашаетесь на использование cookies.