Диагностика плацентарной дисфункции на поздних сроках беременности у кобыл

2015-01-01

Введение

В настоящее время большой интерес вызывает разработка и внедрение в практику экспресс-индикаторов физиологического состояния организма животного. Современный уровень клинической диагностики позволяет создавать тест-системы с высокой чувствительностью и точностью прогнозов. Большую популярность приобрела методика иммунохроматографии благодаря своей простоте и точности [6, 10].

Иммунохроматографический анализ (ИХА) — иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующим ему антителом в мембране. Проводится с помощью специальных тест полосок, панелей или иных тест-систем [7].Тест- система представляет собой мультимембранный композит, на определенные участки которого предварительно нанесены все необходимые для анализа реагенты [13, 16]. Контакт с жидкой пробой инициирует движение ее компонентов вдоль мембран тест-системы под действием капиллярных сил (рисунок 1).

Принцип действия состоит в том, что при нанесении биологической жидкости (кровь, сыворотка, моча, гемогинезат тканей) на тест, она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом [1, 11].По мере продвижения растворов мембрана последовательно окрашивается в области фронта жидкости. Появление на мембране двух окрашенных полос свидетельствует о положительном результате исследования: выявлении антигена в концентрации не ниже контролируемой [12].

При диагностике плацентарной недостаточности целесообразно использовать в качестве антигена релаксин – белковый гормон плаценты. [2, 3]. Этопептидный гормон с молекулярной массой 6500 Да, принадлежащий к семейству инсулино-подобных гормонов [15]. Релаксин синтезируется в большом количестве клетками плацентарного комплекса, за счет чего является наиболее информативным маркером его функционального состояния. В норме релаксин на 44 неделе в крови кобыл определяется в концентрации не ниже 58 нг/мл[13, 14]. Исследования показали, что снижение релаксина ниже данной границы свидетельствует о развивающейся плацентарной недостаточности с последующей угрозой аборта. Физиологическая роль релаксина в поддержании благополучия беременности у кобыл объясняется следующим: 1) расширение сосудов матки и плацентарного комплекса; 2) хронотропное действие на сердечную мышцу; 3) угнетение агрегации тромбоцитов и их релиз в мегакариоцитах; 4) влияние на секрецию гормонов гипофиза; и 5) регуляция баланса жидкости [21, 33].

Релаксин был открыт в 1977 году Швабе. Позже была расшифрована его пространственная структура с учетом видовых особенностей десятка животных, в том числе и лошади. Стевард Д.Р. в 1991 году опубликовал статью о методе очистки нативного релаксина лошади. Данные открытия позволили создавать синтетический релаксин, пригодный для производства тест-систем в качестве аналитически чистого стандартного образца релаксина [9].

Для собак, кошек, свиней, коров и лошадей были созданы иммуноферментные и иммунорадиоактивные методы детекции релаксина в биологических жидкостях. Данные методики трудоемки, воспроизводятся только в лабораторных условиях в течение суток и пригодны только в научных целях. Особую популярность на рынке диагностикумов приобрели ИХА тесты на релаксин для собак и кошек. Однако пока не получено ни одного патента на метод иммунохроматографического анализа релаксина у лошадей [4, 5, 8].

Материалы и методы

Работа проходила в несколько этапов. Первый: получение гипериммунной сыворотки к релаксину лошади по короткой схеме иммунизации кроликов. Второй: получение поликлональных антител к релаксину лошади из гипериммунной сыворотки кроликов методом аффинной очистки. Третий: получение конъюгатаполиклональных антител к релаксину лошади с коллоидным золотом. Четвертый: получение антивидовой сыворотки на мышах, иммунизируя их по короткой схеме поликлональными антителами кролика к релаксину лошади. Пятый: получение поликлональных антител мыши к поликлональными антителами кролика к релаксину лошади. Шестой: нанесение иммобилизованных поликлональных антител к релаксину лошади и поликлональных антител мыши в зону тест-полоски и контроль- полоски соответственно. Нанесение конъюгата на специальную мембрану.

В эксперименте использовались 5 кроликов породы шиншилла и 5 белых мышей для получения поликлональных сывороток. Кроликам вводили антиген RLN2 (релаксин 2 лошади, HolzelDiagnostikaGmbH, Германия) дважды с двух- недельным интервалом подкожно в подушечки задних лап. Первое введение – 100 мкг антигена на животное. Раствор антигена смешивали с 200 мкг адъюванта Фрейда. Второе введение – 100 мкг с 200 мкг неполным адъювантом Фрейда. На третий день после повторной иммунизации отбиралась кровь из ушной вены (10 мл) в центрифужную стерильную пробирку JetBiofit (Россия). Мышам вводился полученный на кроликах анти-антиген по той же схема (рисунок 2).

При получение поликлональных антител клеточные элементы из сывороток удалялись цен- трифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин. Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревали в течение 30 мин при 56° С. Использовалась афинно очищенная IgG- фракция иммунной сыворотки. Её получение, а также конъюгация антигена с коллоидным золотом проводили по стандартным протоколам.

Изготовление тест-систем включало следующие стадии: 1 – нанесение растворов на рабочую мембрану для формирования аналитической и контрольной зон; 2 – нанесение раствора конъюгата маркер-антитело на стекловолоконную мембрану; 3 – высушивание мембран с нанесенными реагентами; 4 – последовательное приклеивание мембран на пластиковую основу (рисунок 3).

На первой стадии на лист рабочей мембраны с помощью микропипетки наносили раствор для формирования контрольной зоны. На стекловолоконную мембрану наносили конъюгат КЗ-антитела при помощи ручного распылителя. Мембраны высушивали и проводили сборку мультимембранного композита, включающего рабочую мембрану, мембраны для конъюгата и образца и впитывающую мембрану.

На последней стадии изготовления наносили аналитическую зону – массив из микроточек. Характеристика микропипетки: объем 1 мг, внутренний диаметр пина – 200 мкм. Объем наноси- мой капли – 20 нл, диаметр формирующейся точки в аналитической зоне мембраны – 250 мкм.

Аналитическая зона находилась на расстоянии 3-х см от подушки с конъюгатом. Тестовая зона – на расстоянии 0,4 см от аналитической зоны.

После нанесения иммунореагентов, мембраны высушивали в течение 20 часов. В помещении, в котором производили нанесение реагентов, поддерживалась температура 20-22°С и влажность не выше 30%.

Результаты исследований и их обсуждение

Было проведено рандоминизированное исследование диагностической эффективности на 20 кобылах. 10 животных были беременны (9-11 месяц) и имели благополучную репродуктивную историю. Беременность установлена методом УЗИ. Другие 10 животных наоборот имели в анамнезе 2 и боле абортов, а при проведении Рис. 1. Строение ИХА тест-системы Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии, гормонального исследования крови, был установлен дисбаланс стероидных гормонов.

В пробирку с 0,1 мл гепарина добавляли 1 мл венозной крови. Пробирку закрывали и медленно переворачивали в течение 30 секунд для перемешивания. Добавляли 1 каплю пробы крови из пробирки на мембрану для пробы. Оставляли тест-систему в горизонтальном положении. Читали результат через 5 минут. Две полоски свидетельствовали о достаточном количестве релаксина (беременность проходит нормаль). Одна контрольная полоска свидетельствует о снижении концентрации релаксина в крови (диагноз плацентарной недостаточности). Одна тестовая полоска, отсутствие полосок или сплошной малиновый фон говорили о нарушении проведения условий теста или о неисправности тест-системы.

От каждого животного было исследовано 2 пробы крови (40 тестов). Было установлено, что пробы крови беременных лошадей окрашивали тест-полоски в малиновый цвет. 6 тестов показали сомнительный результат (30%). Пробы крови лошадей с патологией беременности не окрашивали тест-полоску в малиновый цвет. 5 результатов было сомнительных (25%).Сомнительные тесты были получены либо из-за нарушений проведения условий теста, либо из-за технических неточностей при ручном изготовлении тест- систем. Тем не менее, полученные результаты говорят о целесообразности дальнейшего изуче- ния иммунохимической детекции релаксина в крови и усовершенствовании тест-полосок для этих целей.

Литература

1. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферменного анализа. М.: Высшая школа, 1991. — 287 с.
2. Милованов А.П. Патология системы мать-плацента-плод, Руководство для врачей. М.:—Медицина, 1999. — 448 с: ил. Рис. 2. Получение поликлональных сывороток. Рис. 3. Последовательность сбора тест-системы. Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии, № 1, 2015 г. 103
3. Филиппов О.С. Плацентарная недостаточность / О.С. Филиппов. – М. :МЕДпресс-информ, 2009. – 160 с. : ил.
4. Федорова М.В., Калашникова Е.П. Плацента и её роль при беременности. – М.: Медицина, 1986, 256 с., ил.
5. Anna Brecht, Cornelia Bartsch, Gert Baumann, Karl Stangl, Thomas Dschietzig. Relaxin inhibits early steps in vascular inflammation. Regulatory Peptides - REGUL PEPTIDES, vol. 166, no. 1, pp. 76-82, 2011.
6. Christian Schwabe and Erixa E Bullesbach. Relaxin: structures, functions, promises, and nonevolution. The FASEB JournalVol. 8 November 1994 pp 1152 – 1160
7. Fitzpatrick J., Fanning L., Hearty S., Leonard P., Manning B.M., Quinn J.G., O'Kennedy R. Applications and recent developments in the use of antibodies for analysis // Analytical Letters. 2000. — V. 33, No 13. — P. 2563-2609.
8. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. NY: Academic Press, 2008. — 1323 p.
9. Hong, C. B. et al. 1993. J. Veter. Diag. Invest. 5:550-566
10. Hong C.B., Donahue J.M., Giles R.C. et al. Etiology and Patology of Equine Placentitis. JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation. 5: 56 – 63 (1993)
11. Koivunen M.E., Krogsrud R.L. Principles of immunochemical techniques used in clinical laboratories // LabMedicine. 2006. — V. 37, No 8. — P. 490-497.
12. Qian S., Bau H.H. Analysis of lateral flow biodetectors: competitive format // Analytical Biochemistry. 2004. — V. 326, No 2. — P. 211-224.
13. Ryan, P. L. et al. 1997. Proc. 15th Equine Nutrition and Physiology Symposium, Fort Worth, Tex., May 28-31
14. Sherwood, O. D. 1994. In: The Physiology of Reproduction, Second Edition. E. Knobil and J. D. Neill (eds.), Raven Press: New York, pp. 861-1009
15. Sutton J.B., Swift S.T. Library of veterinary practice. Allen`s Fertility and Obstetrics in the horse. Secondedition, Blackwell, England, 1996
16. Wong R.C., Tse H.Y. Lateral Flow Immunoassay. — NY: Humana Press, 2009. —236 p. УДК 615.357:615.28:612.6:636.2